TÓM TẮT:
Mục tiêu chính của đề tài là tối ưu hóa điều kiện trích ly anthocyanin từ lá Cẩm (Peristrophe bivalvis (L.) Mer.), và đánh giá khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin trong dịch chiết. Các điều kiện tối ưu để trích ly anthocyanin ở quy mô phòng thí nghiệm: trích với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 40/1 (ml/g), tại 43.5oC, trong thời gian 63 phút. Hàm lượng anthocyanin thu được khoảng 1,236 mg/g. Dung môi sử dụng là nước - acid acetic: 100/0.1 (ml/ml).
Từ khóa: Lá Cẩm, anthocyanin, Peristrophe Bilvalvis (L.).
1. Đặt vấn đề
Cây lá Cẩm (Peristrophe bivalvis (L.) Merr) hay còn gọi là cây nhuộm màu là cách gọi của người Việt Nam để chỉ loài cây ưa ẩm và ưa bóng râm, thường phân bố rải rác ở hầu hết các tỉnh phía Bắc nước ta. Anthocyanin trong lá Cẩm được xác định bao gồm 2 loại khung chính là perlagonidin và pyranopeonidin [1]. Anthocyanin là những gốc glucozit do gốc đường glucose, galactose,... kết hợp với gốc aglucon qua liên kết glycoside, thuộc nhóm flavonoid, là sắc tố trong không bào thực vật tan trong nước chịu trách nhiệm về màu đỏ sáng, tím hoặc màu xanh của hoa, vỏ, hạt, quả và lá [2]. Anthocyanin là đại diện cho những chất chống oxy hóa quan trọng, có vai trò tích cực trong phòng chống và giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ung thư, kháng viêm và có nhiều hoạt tính chống lại bệnh tật khác [3]. Athocyanin không có độc tính và không có bất kì giới hạn tối đa nào cho các ứng dụng trong thực phẩm.
Hiện nay, việc sử dụng chất màu tự nhiên trong thực phẩm đang được ưa chuộng, đem lại nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng chất màu tổng hợp, vì ngoài việc tạo màu, chúng còn an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao. Do đó, chất màu anthocyanin được sử dụng rộng rãi trong các hoạt động sản xuất công nghiệp [4]. Anthocyanin đã được chấp nhận làm chất màu sử dụng trong thực phẩm ở Hoa Kỳ trong danh mục chất màu nước ép trái cây (21 CFR 73.250) hoặc chất màu nước ép rau quả (21 CFR 73.260). Tại châu Âu, anthocyanin được xếp vào các chất màu có nguồn gốc tự nhiên [5]. Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra điều kiện tối ưu để trích ly anthocynin từ lá Cẩm.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
Nguyên liệu: Lá Cẩm tươi sau thu hoạch được, rửa sạch, sấy khô và xay nhỏ với kích thước < 0.5mm. Bảo quản trong bao bì hút chân không rồi bảo quản ở 50C.
Hóa chất: ethanol, isopropanol, iod, kali iodua, 1-a naphthol, acid sunfuric, acid acetic, natri hydroxit, sắt(III) clorua, acid clohydric, chloroform đều xuất xứ từ Trung Quốc.
Thiết bị: Máy đo pH S220 (METTLER TOLEDO, Thụy Sĩ), máy UV-vis (Thermo Spectronic Mỹ), bếp khuấy từ gia nhiệt (Scilogex, Mỹ), cân phân tích DJ 620-S (DJ, Đức), máy ly tâm EBA 200 (Hettich, Đức).
2.2. Phương pháp phân tích
Xác định độ ẩm của nguyên liệu lá Cẩm bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi [7] và ẩm độ của cao thành phẩm cuối cùng bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở 75oC; độ tro của nguyên liệu được xác định theo TCVN 5253:1990; Định tính các thành phần alkaloids, carbohydrate, glycosid, flavonoid, phenol, tannin, axit amin, protein, saponin, sterol, terpenoids, quinon, oxalat [8] để xác nhận sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong dịch chiết lá Cẩm và trong cao thành phẩm.
Xác định hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi sai: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối được xác định theo phương pháp pH vi sai (Giusti và Wrolstad, 2000) và được tính quy theo cyanidin-3-glucoside. Cyanidin-3-glucoside được chọn vì đây là dạng phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên. Dịch chiết thu được ở các thí nghiệm được xác định hàm lượng anthocyanin dựa trên nguyên tắc anthocyanin thay đổi màu theo pH. Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, tại pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Phương pháp pH vi sai cho phép xác định hàm lượng anthocyanin tổng số chính xác và nhanh chóng, thậm chí khi có sự hiện diện của các hợp chất can thiệp khác [10]. Mẫu được pha loãng trong 2 dung dịch đệm: đệm kali clorua 0,025 M (pH 1.0) và đệm natri axetat 0,4 M (pH 4.5). Tất cả các phép đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ được thực hiện ở bước sóng 500nm và 700nm [10].
Xác định anthocyanin theo công thức:
Trong đó: A là độ hấp thu của anthocyanin với: A = (Aλvis max – A700nm)pH 1.0 – (Aλvis max – A700nm)pH 4.5; MW = 449.2 g/mol là khối lượng phân tử của cyanidin-3-glucosdie, DF là độ pha loãng; V là thể tích dịch chiết; l là bề dày cuvet (cm); e = 26900 là hệ số hấp thu phân tử của cyanidin-3-glucosdie (l.mol-1.cm-1); mNL là khối lượng nguyên liệu (g); w là ẩm độ nguyên liệu; a là lượng anthocyanin (g).
2.3. Phương pháp thực hiện
Lá Cẩm được làm sạch để loại bỏ những bụi bẩn và tạp chất, hạn chế tới mức tối đa việc tạp nhiễm gây sai số trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Sau đó, tiến hành sấy khô nguyên liệu (ẩm độ 3,293%) ở máy sấy khay. Sau quá trình sấy, lá Cẩm được xay nhỏ (kích thước rây 0,5 mm) để giảm kích thước nguyên liệu, tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, giúp tăng hiệu quả trích ly. Tiến hành tách cholorophyll ở điều kiện tối ưu đã nghiên cứu từ trước (dung môi: cồn 96, tỉ lệ dung môi và nguyên liệu là 30:1, thời gian: 97 phút, nhiệt độ: 49oC). Sau đó, trích ly anthocyanin với dung môi ở các điều kiện khác nhau để khảo sát điều kiện chiết tối ưu. Lấy dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc, định mức và đo quang ở bước sóng thích hợp để xác định hàm lượng anthocyanin có trong dịch chiết. Cuối cùng, khảo sát các điều kiện để tạo sản phẩm bột màu.
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Khảo sát thành phần, đặc tính hóa lý của nguyên liệu lá Cẩm
Lá Cẩm nguyên liệu được phân tích các chỉ số độ ẩm, độ tro, định tính các thành phần alkaloids, carbohydrate, glycosid, flavonoid, phenol, tannin, axit amin, protein, saponin, sterol, terpenoids, quinon, oxalate, xác định hàm lượng chất tan được trình bày ở mục 2.2.
2.4.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly đến hàm lượng anthocyanin
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên kiểu luân phiên từng biến một yếu tố theo thứ tự là: loại dung môi (nước cất, ethanol 99,5% và acid acetic 0.1%), tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu (50/1, 75/1, 100/1, 150/1 ml/g), nhiệt độ chiết (khoảng 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC), thời gian chiết (30, 60, 90 phút) và tốc độ khuấy (100, 200 và 300 vòng/phút). Kết quả lựa chọn khi khảo sát các yếu tố trước được sử dụng để khảo sát cho yếu tố sau. Điều kiện ban đầu là 100ml dung môi/ 1g nguyên liệu với thời gian chiết 60 phút tại nhiệt độ phòng (khoảng 30oC), dịch chiết không có tác động khuấy. Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng anthocyanin. Ba yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết được bố trí theo kiểu trục quay tâm (Rotatable Central Composite Design) để xác định ảnh hưởng của các yếu tố và tối ưu hóa quy trình chiết anthocyanin bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM. Cao màu thành phẩm được xác định ẩm độ, định tính alkaloids, tannin, glycosides, resins, flavonoid, sterol, saponin, carbohydrates, phenol, terpenoids.
2.5. Xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, được tính toán và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft® Office Excel 2013. Phân tích thống kê ANOVA và trắc nghiệm LSD được sử dụng để so sánh ảnh hưởng của các yếu tố, được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV 9 (Statgraphics Technologies, Inc., USA) và sự hỗ trợ của phần mềm thống kê JMP 10. Độ tin cậy 95% được áp dụng cho tất cả các phép thống kê.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Khảo sát nguyên liệu và thành phần hóa học của lá Cẩm
Lá Cẩm tươi chứa hàm lượng nước cao có độ ẩm là 75.324%, độ tro là 3.293%. Ở độ ẩm trên, các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc) vẫn có thể phát triển được nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng trong môi trường ẩm. Do đó, muốn bảo quản trong thời gian dài, nên sấy khô rồi đựng nguyên liệu trong bao bì hút chân không rồi bảo quản ở 5oC. Mặt khác, việc sấy khô lá cẩm và bảo quản ở dạng bột khô vẫn là giải pháp thuận tiện, giúp chủ động được nguồn nguyên liệu trong sản xuất. Qua kết quả định tính thành phần hóa học của nguyên liệu cho thấy có sự xuất hiện của tanin, alkaloid, flavonoid, cacbohydrat và glycoside, Quines. Khi thay đổi pH từ 1 - 14, màu sắc dịch chiết bằng dung môi nước thay đổi (Hình 1). Trong môi trường axit (pH < 7), các anthcyanin có màu đỏ cam, duy ở mức pH = 4, anthocyanin không bền và chuyển thành màu cam. Ở pH = 7 - 11, các anthocyann tồn tại dưới dạng base quinon nên có màu tím. Từ pH = 12 - 14, anthocyanin có sự chuyển đổi từ xanh dương đậm đến xanh lá nhạt (hơi ngả vàng) vì có sự chuyển đổi từ dạng quinoidal anhydro thành dạng chalcon.
Hình 1: Màu sắc dịch chiết lá Cẩm thay đổi theo pH
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm lượng anthocyanin
Hình 2: Ảnh hưởng của loại dung môi lên hàm lượng anthocyanin
Hình 2 cho thấy, loại dung môi khác nhau sẽ thu được hàm lượng anthocyanin khác nhau. Hàm lượng anthocyanin thu được từ dung môi acid acetic 0,1% là cao nhất và dung môi ethanol 99,5% cho hàm lượng anthocyanin là thấp nhất. Vì anthocyanin là hợp chất khá phân cực nên sẽ tan tốt trong các dung môi phân cực. Dung môi càng phân cực sẽ chiết được càng nhiều anthocyanin. Kết quả ANOVA cho thấy yếu tố loại dung môi có ảnh hưởng tới hàm lượng anthocyanin có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Kiểm tra sự khác biệt giữa các loại dung môi bằng phương pháp LSD thấy sự khác biệt giữa 3 loại dung môi. Vậy nên, ta chọn dung môi axit acetic 0,1% trong các thí nghiệm tiếp theo để thu được hàm lượng anthocyanin là cao nhất.
Hình 3: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu lên hàm lượng anthocyanin
Hình 3 cho thấy với tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu = 75:1 (v:w) cho hàm lượng anthocyanin cao nhất (0,885 mg/gNL) còn tỉ lệ 150:1 cho hàm lượng thấp nhất (0,679 mg/gNL). Từ tỉ lệ 50:1 đến 75:1 hàm lượng anthocyanin thu được tăng. Nhưng từ 75:1 đến 150:1 thì hàm lượng anthocyanin thu được lại giảm dần. Với điều kiện chiết ở nhiệt độ phòng (30oC) trong thời gian 1 giờ thì toàn bộ khối nguyên liệu được tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. Do đó, lượng anthocyanin khuếch tán vào dung môi là cao nhất. Kết quả ANOVA cho thấy, yếu tố tỉ lệ dung môi có ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Kết quả LSD cho thấy giữa tỉ lệ 50:1 và 125:1 không có sự khác biệt và tỉ lệ 75:1 và 100:1 ít có sự khác biệt, nhưng tỉ lệ 75:1 cho hàm lượng anthocyanin nhiều hơn. Do đó, chọn tỉ lệ 75:1 cho các thí nghiệm sau để vừa tiết kiệm dung môi vừa thu được hiệu quả chiết cao nhất.
Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng anthocyanin
Hình 4 cho thấy với điều kiện chiết trong 1 giờ, từ 30oC đến 50oC hàm lượng anthocyanin tăng dần, từ 50oC đến 70oC có xu hướng giảm. Nhiệt độ cho hàm lượng anthocyanin cao nhất là 50oC (1,099 mg/gNL) và thấp nhất là 70oC (0,472 mg/gNL). Ở nhiệt độ cao (từ 70oC), anthocyanin dễ bị biến tính và mất dần nên ở điều kiện chiết 70oC thu được hàm lượng anthocyanin là thấp nhất. Kết quả ANOVA cho thấy, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin, có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Kết quả LSD chỉ ra sự khác biệt giữa các nhiệt độ chiết. Do đó, ta chọn 50oC là nhiệt độ chiết tối ưu trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng anthocyanin
Hình 5 cho thấy khi tăng thời gian từ 30 phút lên 60 phút thì hàm lượng anthocyanin tăng nhưng khi tăng thời gian chiết lên 90 phút thì lượng anthocyanin giảm. Hàm lượng anthocyanin cao nhất thu được ở thời gian 60 phút (1.203 mg/gNL). Sự oxy hóa được xem là một tác nhân ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin. Theo thời gian, lượng anthocyanin được hòa tan vào dung môi ít hơn so với lượng anthocyanin bị oxy hóa, do đó lượng anthocyanin giảm dần. Trong bảng ANOVA, P = 0.0122 (< 0,05) nên yếu tố thời gian có ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin là có ý nghĩa với mức độ tin cậy là 95%. Kết quả LSD chỉ ra sự khác biệt giữa 60 phút với 2 mức thời gian còn lại. Do đó, ta chọn 60 phút là điều kiện chiết cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 6: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hàm lượng anthocyanin
Hình 6 cho thấy tốc độ khuấy càng tăng thì hàm lượng anthocyanin thu được càng giảm. Hàm lượng anthocyanin thu được cao nhất khi khuấy là 0,216 mg/gNL (ở điều kiện khuấy 50v/p) thấp hơn rất nhiều so với hàm lượng anthocyanin thu được khi không khuấy (1,203 mg/gNL). Khi khuấy, làm tăng lượng oxy trong không khí lần vào trong dung môi. Tốc độ khuấy càng cao thì oxy hòa tan trong dung môi càng nhiều, dẫn đến lượng anthocyanin bị mất đi do sự oxy hóa càng nhiều, gây nên hiện tượng giảm hàm lượng anthocyanin. Do đó, yếu tố khuấy không áp dụng trong quá trình chiết anthocyanin từ lá Cẩm.
Dựa vào kết quả các thí nghiệm khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin, ta chọn tâm như sau: tỉ lệ dung môi: nguyên liệu: 75:1 (v:w), nhiệt độ chiết: 50oC, thời gian chiết: 60 phút. Từ các yếu tố đã chọn, ma trận thí nghiệm tối ưu được thiết lập theo kiểu quay tâm như Bảng 1.
Bảng 1. Bảng mã hóa biến trong tối ưu
| Yếu tố | -1 | 0 | +1 |
| Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu (v:w) | 50:1 | 75:1 | 125:1 |
| Nhiệt độ chiết (oC) | 40 | 50 | 60 |
| Thời gian chiết (phút) | 30 | 60 | 90 |
Hình 7: Biểu đồ dự đoán hàm lượng Athocyanin
Từ Hình 7, ta thấy P = 0.004 (< 0.05) và RSq = 0.96 (> 0.8) có nghĩa là mô hình dự đoán tuyến tính được xem là tốt, phù hợp để sử dụng. Do đó, phương trình dự đoán hàm lượng anthocyanin là: y = -0.24x12 - 0.365x32 + 0.021x1x2 - 0.116x1 - 0.183x2 + 1.148
Trong đó: x1 là nhiệt độ (oC); x2 là tỉ lệ; x3 là thời gian (phút). Phương trình hồi quy này được dùng như một mô hình để dự đoán được hàm lượng anthocyanin với các điều kiện nhiệt độ, tỉ lệ và thời gian tương ứng.
Bảng 2. Bảng đối chiếu điều kiện tối ưu và thực tế
| Điều kiện chiết | Lý thuyết | Chọn thực tế |
| Nhiệt độ (oC) | 43.48580776 | 43.5 |
| Tỉ lệ dung môi: nguyên liệu (v:w) | 39.62616834:1 | 40:1 |
| Thời gian (phút) | 63.38824601 | 63 |
| Hàm lượng athocyanin (mg/gNL) | 1.236 | 1.202 ± 0.041 |
Tiến hành thực nghiệm với các điều kiện dự đoán, thu được hàm lượng anthocyanin trung bình là 1,202 ± 0,041 (mg/gNL), sai số bé hơn 5% so với hàm lượng dự đoán theo lý thuyết. Điều này chứng tỏ mô hình này có ý nghĩa và phù hợp để tách chiết anthocyanin trong lá Cẩm. Khi đánh giá chất lượng cao thành phẩm thu được ẩm độ cao màu là 7,129%, vẫn còn sự hiện diện của ankaloids, tanins, glycosides, flavonoid, terpenoid và carbohydrat so với nguyên liệu ban đầu. Vì thế, các nghiên cứu tiếp theo cần nghiên cứu về điều kiện tinh sạch cao để nâng cao hàm lượng anthocyanin.
4. Kết luận
Điều kiện tối ưu để chiết anthocyanin từ lá Cẩm là sử dụng dung môi là nước - axit acetic có tỉ lệ là 100:1 (v:v) trong 63 phút tại 43.50C, với tỉ lệ dung môi: nguyên liệu là 40:1 (v:w).
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Bùi Xuân Tỉnh, (2011), Nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của chất màu từ lá Cẩm (Peristrophe bivalvis), Đại học Đà Nẵng.
2. Gross J. 1987. Pigments in Fruits. London: Academic Press.
3. Farah S. Hosseinian, Wende Li, Trust Beta (2007). Measurement of anthocyanins and otherphytochemicals in purple wheat. Food Chemistry 109 916 - 924.
4. Brasil. (2001). Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Resolução da Diretoria Colegiada n0 34. Aprova o regulamento técnico sobre uso de aditivos alimentares. Diário Oficial da União, Brasília.
5. Tim Langrish and Don Chiou (2008) Stabilization of Moisture Sorption in Spray-Dried Bioactive Compounds by Using Novel Fibre Carriers to Crystallize the Powders. International Journal of Food Engineering, 4 (1).
6. Lapornik B., Prosek M., Wondra A.G. (2005). Comparison of extracts prepared from plant byproducts using different solvents and extraction time. Journal of Food Engineering, 71 214 - 222.
7. Lê Thị Mùi. (2009). Kiểm nghiệm và phân tích thực phẩm. Đại học Đà Nẵng.
8. Sriyeta Chakraborty, Souvagyalaxmi Sahoo, Bhagat A., et al. (2017), Studies On Antimicrobial Activity, Phytochemical Screening Tests, Biochemical Evaluation Of Clitorea Ternatea Linn. Plant Extracts, Zenodo.
9. Giusti M. M. and Wrolstad R. E. (2000). Characterization and Measurement of Antocyanins by UV-Visible Spectroscopy, John Wiley & Sons, Inc.
10. Gabriela và cộng sự. (2010). Spectrophotometric study on stability of anthocyanins extracts from black grapes skins.Ovidius University Annals of Chemistry. Volume 21, Number 1, pp. 101 - 104.
OPTIMIZATION EXTRACTION
CONDITION OF ANTHOCYANIN FROM
Peristrophe Bilvalvis (L.) Merr Leaf
● DR. MAI HUYNH CANG
● DO THI THUY TIEN
● NGUYEN THI TU
Department of Chemical engineering and processing
Nong Lam University of Ho Chi Minh City
ABSTRACT:
The objective of research is optimisation conditions for anthocyanin extraction from the Peristrophe bivalvis (L.) Mer leaf. Optimum conditions for anthocyanin extraction in laboratory scale were ratio of 40/1 (ml/g), 43.5oC and 63 minutes for ratio of solvent/material, extraction temperature and extration time, respectively. The solvent extraction was H2O - acid acetic: 100/0.1 (ml/ml).
Keywords: Peristrophe bivalvis (L.) Mer leaf, anthocyanin.
