TÓM TẮT:
Từ 263 chủng vi khuẩn lactic, nghiên cứu đã tuyển chọn được 2 chủng có khả năng ứng dụng để lên men lá của hai giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên đang được trồng đại trà ở Việt Nam.
Kết quả thực nghiệm cho thấy, 2 chủng tuyển chọn VTCCB-439 và VTCCB-411 khi lên men 3 ngày trên cơ chất lá chè đã thu được GABA với hàm lượng tương ứng là 0,897 và 0,815 mg/ml dịch chiết của chè. Bên cạnh đó, nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp nuôi cấy của 2 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn là nguồn nitơ từ cao thịt, nguồn cacbon từ glucoza và lactoza, thời gian lên men thu GABA cao nhất là 2 ngày.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, chè Phúc Vân Tiên, chè Kim Tuyên, sinh tổng hợp Gama Amino Butylic Axit ( GABA), chè giàu GABA.
1. Đặt vấn đề
GABA có công thức phân tử C4H9NO2, là một hợp chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có hoạt tính sinh học cao, có khả năng giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh về tim mạch và thần kinh của con người như bệnh Huntington, Parkison, Alzheimer [1].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy: Một số chủng vi khuẩn lactic, trong quá trình sinh trưởng và phát triển có khả năng sinh tổng hợp ra enzym glutamatedecarboxylaza (GAD). Nếu trong môi trường có sự hiện diện của muối glutamat thì enzym GAD sẽ xúc tác để chuyển đổi thành GABA [2, 3].
Những nghiên cứu của các tác giả ở Nhật và Đài Loan đã thu được kết quả là khi lên men lá chè xanh ở điều kiện yếm khí, thu được lượng GABA đáng kể, yếu tố này đã làm tăng thêm chất lượng sản phẩm của lá chè [4, 5].
Trong [6] nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tuyển chọn được 2 giống chè của Việt Nam là Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên là đối tượng tốt nhất cho việc sản xuất chè đen. Theo đó, sẽ công bố một số kết quả về tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic để lên men 2 giống chè này, nhằm thu được sản phẩm chè đen giàu GABA.
2. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic tốt nhất.
- Nghiên cứu các điều kiện sinh trưởng tốt nhất.
- Nghiên cứu tạo chế phẩm.
- Thử nghiệm lên men trên 2 giống chè với mục tiêu thu chè đen có hàm lượng GABA cao nhất.
3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn được cung cấp từ Bảo tàng Giống chuẩn, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Chè búp giống Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên trồng tại Viện Khoa học Nông lâm miền núi phía Bắc, thu hái vào tháng 12 năm 2018.
- Môi trường nhân giống: M1 (MRS), M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8.
- Định tính GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
- Định lượng GABA bằng phương pháp quang phổ.
4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt lực glutamat decarboxylaza cao nhất.
Từ 263 chủng vi khuẩn lactic lưu giữ tại Bảo tàng Giống vi sinh vật Việt Nam đã chọn được 4 chủng có hoạt lực Glutamat decarboxylaza cao nhất. Kết quả xác định định tính được thể hiện ở Bảng 1.
Bảng 1. Các chủng có khả năng sinh tổng hợp glutamat decarboxylaza cao
|
Thứ tự |
Tên chủng |
Lần 1 |
Lần 2 |
Lần 3 |
|||
|
OD600 |
Kết quả |
OD600 |
Kết quả |
OD600 |
Kết quả |
||
|
1 |
VTCCB-439 |
2,688 |
+ |
2,883 |
+ |
2,591 |
+ |
|
2 |
VTCCB-411 |
2,431 |
+ |
2,603 |
+ |
2,668 |
+ |
|
3 |
66 |
2,564 |
+ |
2,768 |
+ |
2,661 |
+ |
|
4 |
67 |
2,442 |
+ |
2,571 |
+ |
2,648 |
+ |
Với môi trường MRS, cả 4 chủng này đều phát triển tốt. Khả năng sinh tổng hợp Glutamat decarboxylaza thể hiện qua trị số OD600 cho thấy, cả 4 chủng có khả năng sinh tổng hợp enzim này vượt trội hơn các chủng còn lại.
Do đó, phù hợp lựa chọn 4 chủng này để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
4.2. Khảo sát khả năng tạo GABA khi lên men lá chè của 4 chủng lựa chọn:
Lá chè được sao, sau đó vò, dập rồi đựng vào các túi zip, bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn vào các túi chè, trộn đều và hút hết khí trong túi. Tiến hành lên men ở nhiệt độ 37 + 10C trong thời gian 4 ngày. Mỗi ngày lấy 3 gam mẫu trong các mẫu thí nghiệm sấy khô. Lấy 1g chè khô chiết với 10ml nước, lắc ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Lấy dịch chiết ly tâm 3.000 vòng/phút. Dịch trong thu được, được định tính bằng sắc ký bản mỏng, định lượng bằng phương pháp quang phổ. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 2.
Bảng 2. Khả năng tạo GABA trên chè lên men của các chủng
vi khuẩn lactic.
|
|
Hàm lượng GABA (mg/ml dịch chất) |
||
|
Sau 1 ngày LM |
Sau 2 ngày LM |
Sau 3 ngày LM |
|
|
VTCC B349 |
0,421 |
0,888 |
0,897 |
|
VTCC B411 |
0,359 |
0,813 |
0,815 |
|
Lact. Brevis 66 |
0,233 |
0,301 |
0,289 |
|
Lact. Brevis 67 |
0,267 |
0,323 |
0,331 |
Số liệu Bảng 2, cho thấy:
- Sau ngày thứ 2 lên men, lượng GABA trong các mẫu tăng lên không đáng kể.
- 2 chủng VTCC B439 và B411 có khả năng sinh tổng hợp GABA tốt hơn so với 2 chủng 66 và 67.
Do đó, chọn 2 chủng VTCC B439 và VTCC B411 để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. Nghiên cứu xác định một số điều kiện phù hợp để nuôi cấy các chủng vi khuẩn được lựa chọn:
4.3.1. Lựa chọn môi trường và xác định thời gian nuôi cấy:
Các chủng vi khuẩn VTCC được nuôi cấy trong các môi trường dịch thể:
M1 (MRS), g/l : Pepton 10, cao nấm men-5, cao thịt-10, glucoza-20, K2HPO4-2, CH3COONa-5, MgSO4-0,2, MnSO4-0,05, Tween -1,08, Amonium citrat-2, pH = 5+ 0,2
Môi trường M1: MRS (Man, Rogosa, Sharpe Broth)(g/l): Peptone-10; Yeast extract-5; Meat extract-10; Glucose-20; K2HPO4-2; CH3COONa -5; MgSO4-0,2; MnSO4-0,05; Tween 80- 1,08; Ammomium citrate-2, pH6.5±0.2.
Môi trường M2 (g/l): Glucose-20; K2HPO4-2; CH3COONa-5; diamonium hydrogen citrate-2; MgSO4-0,2; MnSO4-0,04; Tween 80-1; yest extract-50,1.
Môi trường M3 (g/l): Glucose-25; yest extract-6,25; peptone-6,25; MgSO4.7H2O-0,2; MnSO4.4H2O-0,05; tween 80-2.
Môi trường M4 (g/l): Glucose-40; peptone-10; yest extract-5; KH2PO4-5; MgSO4.7H2O-2
Môi trường M5 (g/l): Glucose-20; peptone-20; yest extract-10
Môi trường M6 (g/l): Glucose-20; cao thịt-10; peptone-10; CH3COONa-5; cao men-5; ammonium citrate-2; K2HPO4-2; MgSO4.7H2O-0,1; MnSO4.5H2O-0,05
Môi trường M7 (g/l): Glucose-10; yest extract-10; peptone-5; CH3COONa-2; MgSO4.7H2O-0,02; MnSO4.4H2O-0,01; FeSO4.7H2O-0,01; NaCl-0.01
Môi trường M8 (g/l): peptone-15; cao thịt-12,5; sucrose-12,5; K2HPO4-1,03; CH3COONa-5; ammonium dibasic citrate-2; CaCl2-2; Tween 80-1
Tất cả các môi trường được bổ sung 1% muối glutamt. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC. Ở các thời điểm 24, 48, 72 và 102 giờ nuôi cấy, lấy mẫu xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD600 và định lượng GABA theo phương pháp đã dẫn. Kết quả thể hiện ở các Bảng 3 và Bảng 4.
Từ kết quả thực nghiệm ở Bảng 3 và Bảng 4 cho thấy:
- Môi trường M2 là môi trường tốt nhất cho cả 2 chủng phát triển.
- Thời điểm tạo GABA nhiều nhất là giờ lên men thứ 48 cho cả 2 chủng.
Do đó, chọn M2 là môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tiếp.
Bảng 3. Khả năng sinh tổng hợp GABA của chủng VTCC B439
|
Môi trường |
Chủng VTCCB439 |
|||||||
|
24h |
48h |
72h |
102h |
|||||
|
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
|
|
M1 |
2.376 |
0.428 |
2.987 |
0.5583 |
3.246 |
0.523 |
3.321 |
0.499 |
|
M2 |
2.729 |
0.633 |
3.286 |
0.8149 |
3.286 |
0.703 |
3.28 |
0.623 |
|
M3 |
1.416 |
0.312 |
2.094 |
0.323 |
2.297 |
0.349 |
0.886 |
0.312 |
|
M4 |
1.407 |
0.232 |
1.477 |
0.303 |
1.564 |
0.289 |
1.012 |
0.2 |
|
M5 |
1.458 |
0.334 |
1.881 |
0.412 |
1.982 |
0.387 |
1.189 |
0.235 |
|
M6 |
1.585 |
0.314 |
1.879 |
0.328 |
1.812 |
0.322 |
2.043 |
0.212 |
|
M7 |
1.262 |
0.413 |
0.824 |
0.545 |
0.801 |
0.468 |
0.365 |
0.321 |
|
M8 |
1.519 |
0.424 |
0.689 |
0.591 |
0.768 |
0.521 |
1.11 |
0.323 |
Bảng 4. Khả năng sinh tổng hợp GABA của chủng VTCC B411
|
Môi trường |
Chủng VTCCB411 |
|||||||
|
24h |
48h |
72h |
102h |
|||||
|
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
OD600 |
GABA |
|
|
M1 |
3.285 |
0.523 |
3.405 |
0.6191 |
3.345 |
0.592 |
3.319 |
0.411 |
|
M2 |
2.831 |
0.602 |
3.136 |
0.8013 |
3.332 |
0.699 |
3.279 |
0.599 |
|
M3 |
1.373 |
0.311 |
1.776 |
0.311 |
2.129 |
0.315 |
1.889 |
0.301 |
|
M4 |
1.298 |
0.241 |
1.292 |
0.297 |
1.256 |
0.267 |
1.058 |
0.225 |
|
M5 |
1.462 |
0.329 |
1.946 |
0.378 |
2.002 |
0.336 |
0.963 |
0.216 |
|
M6 |
1.686 |
0.327 |
1.809 |
0.397 |
1.987 |
0.364 |
2.011 |
0.217 |
|
M7 |
1.142 |
0.439 |
1.724 |
0.599 |
1.977 |
0.432 |
1.217 |
0.304 |
|
M8 |
1.553 |
0.436 |
1.535 |
1.545 |
0.562 |
0.537 |
0.664 |
0.334 |
4.3.2. Lựa chọn nguồn nitơ và carbon thích hợp
Môi trường dịch thể M2 với nguồn nitơ cao nấm men được thay thế bởi cao thịt, pepton, trypton ure, NH4+, NO2-, NO3-, còn nguồn carbon từ glucoza được thay thế bằng các nguồn: Galactoza, saccharoza, mactoza, maniton và lactoza.
Nuôi cấy ở nhiệt độ 35oC, trong 2 ngày, các mẫu được đem phân tích OD600. Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở các Biểu đồ 1 và Biểu đồ 2.
Biểu đồ 1: Sinh trưởng của các chủng với các nguồn nitơ khác
Biểu đồ 2: Sinh trưởng của các chủng với các nguồn carbon khác nhau
Từ Biểu đồ 1 cho thấy :
- Nguồn Nitơ hữu cơ tốt hơn vô cơ, mật độ cực đại của vi khuẩn cao hơn hẳn.
- Đối với cả 2 chủng, nguồn nitơ tốt nhất cho sinh trưởng là cao thịt và pepton.
Từ Biểu đồ 2 cho thấy:
- Glucoza (DC+) và lactoza là 2 nguồn cung cấp carbon tốt nhất.
4.3.3. Lựa chọn pH thích hợp của môi trường
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch thể M2 với các mốc của pH là: 4,5,6,7 và 8. Sau 24 giờ nuôi cấy, kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng
sinh trưởng của vi khuẩn.
|
Chủng |
pH nuôi cấy |
|||||||||
|
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
||||||
|
OD600 |
pH |
OD600 |
pH |
OD600 |
pH |
OD600 |
pH |
OD600 |
pH |
|
|
VTCCB439 |
1.434 |
4.18 |
1.989 |
4.76 |
2.767 |
4.95 |
2.539 |
4.31 |
1.989 |
5.75 |
|
VTCCB411 |
1.589 |
4.01 |
2.231 |
4.25 |
2.789 |
3.97 |
2.601 |
4.02 |
2.014 |
5.1 |
Từ Bảng 5 cho thấy, cả 2 chủng vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất ở khoảng pH = 6 - 7.
5. Kết luận
Từ những số liệu thực nghiệm đưa đến một số kết luận sau đây:
+ Từ bộ sưu tập bộ chủng vi khuẩn lactic của Bảo tàng Giống chuẩn Việt Nam đã lựa chọn được 2 chủng VTCC B439 và VTCC B411 (*) có khả năng sinh sống hợp GABA cao nhất khi lên men trên lá chè.
+ Môi trường phát triển tốt nhất cho 2 chủng là môi trường M2.
+ Nguồn nitơ tốt nhất cho 2 chủng là cao thịt, nguồn carbon tốt nhất là glucoza và lactoza, thời gian lên men thu GABA cao nhất là 2 ngày; pH thích hợp của môi trường là 6 - 7.
(*)Bài viết đã tiến hành công tác phân loại để định danh các chủng, kết quả là chủng VTCC B439 thuộc loài B.plantarum, còn chủng VTCC - B411 thuộc loià Locasei. Vì khuôn khổ bài báo, tác giả không trình bày chi tiết.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
- Wong, C. G., Bottiglieri, T., Snead, O. C. (2003). GABA, gammahydroxybutyric acid, and neurological disease. Annals of Neurology, 54(6), 3-12.
- Bouche´, N., Fromm, H. (2004). GABA in plants: just a metabolite?. TRENDS in Plant Science9 No.3.
- Kook M.C. (2010). Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16. Microbiol. Biotechnol, 20(4), 763-766.
- Đại học Quốc gia Jeju - Hàn Quốc (2012), Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học năm 2012 của Khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học khoa học ứng dụng, Hàn Quốc.
- Wang, F., Tsai, Y. S., Lin, M. L. and Shau-Mei, O. A. (2006). Comparison of Bioactive Components in GABA Tea and Green Tea Produced in Taiwan. Food Chem., 96, 648-653.
- Nguyễn Việt Tấn và cộng sự (2019). Nghiên cứu, khảo sát lựa chọn giống chè phù hợp để sản xuất chè GABA. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 37:39-41.
Selecting the strains of lactic acid bacteria which are able to produce highly active Glutamate decarboxylase in order to ferment Gamma Aminobutyric Acid biosynthesis – rich black tea
Master. Nguyen Viet Tan
Department of Science and Technology, Ministry of Industry and Trade
Assoc.Prof. Ph.D Nguyen Duy Thinh
Hanoi University of Science and Technology
Assoc.Prof. Ph.D Nguyen Duy Lam
Vietnam Institute of Agricultural Engineering and Post-harvest Technology
ABSTRACT:
Two strains of lactic acid bacteria are selected from 263 strains of lactic acid bacteria to ferment Phuc Van Tien tea and Kim Tuyen tea which are widely grown in Vietnam. This study’s findings indicate that when two selected strains of lactic acid bacteria, VTCCB-439 and VTCCB-411, are fermented for 3 days, GABA is collected at 0.897 and 0.815 mg / ml of the tea extract, respectively. This study finds out the suitable culture conditions for these two chosen strains of lactic acid bacteria are nitrogen source from meat extract, carbon source from glucose and lactose. The study also finds out that the highest fermentation time for GABA collection is 2 days.
Keywords: Lactic bacteria, Phuc Van Tien tea, Kim Tuyen tea, Gamma Aminobutyric Acid biosynthesis (GABA), GABA-rich tea.
[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 21, tháng 8 năm 2020]
