Tác dụng điều hòa đường huyết của cao chiết từ vỏ hạt cà phê coffea canephora

TÓM TẮT:

Thành phần vỏ cà phê chứa những hợp chất caffeine, tannin, polyphenol, pectin, monosaccharide có tác dụng cải thiện lượng glucose trong máu và kích thích tiết insulin. Trong nghiên cứu này, đã đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase, độc tính cấp tính và tác dụng điều hòa glucose huyết tương trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống ở chuột bình thường của dịch chiết từ vỏ cà phê Coffea canephora. Kết quả cho thấy, dịch chiết vỏ cà phê Coffea canephora (5000 mg/kg) không gây độc tính cấp tính ở động vật thí nghiệm. Dịch chiết vỏ cà phê Coffea canephora có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh (IC₅₀= 0.82 µg/mL) mạnh hơn acarbose (IC₅₀= 138,2 µg/mL). Ngoài ra, kết quả còn cho thấy dịch chiết vỏ cà phê Coffea canephora liều (0,3 g/kg và 0,6 g/kg) có tác dụng điều hòa glucose huyết tương trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống ở chuột bình thường, nhưng yếu hơn so với glibenclamide. Trong đó, liều 0,6 g/kg cho thấy tác dụng điều hòa glucose huyết tương tốt hơn liều thử nghiệm 0,3 g/kg thể trong chuột.

Từ khóa: vỏ hạt cà phê, ức chế enzyme α-glucosidase, độc tính cấp, dung nạp glucose đường uống.

1. Đặt vấn đề

Cà phê (Coffea canephora) thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) thường được trồng và phát triển ở vùng nhiệt đới/cận nhiệt đới như các nước thuộc Nam Mỹ (Brazil và Colombia), châu Á, châu Đại Dương, châu Phi, Trung Mỹ và Mexico. Các hợp chất sinh học chủ yếu được tìm thấy trong vỏ cà phê là acid cholorogenic, trigonelline, anthocyanin, acid protocatechuic, acid gallic, rutin, caffeine,… Nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong vỏ cà phê như flavanol, flavonol, anthocyanidin, proanthocyanidin, acid hydroxybenzoic, acid hydroxycinnamic [1]. Ontawong và cộng sự (2019) đã chứng minh dịch nước từ vỏ cà phê có hoạt tính kháng oxy hóa khi khảo sát theo các phương pháp khác nhau như khả năng bắt gốc tự do DPPH hay ABTS, năng lực khử sắt FRAP, khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động ORAC. Ngoài ra, nghiên cứu Ontawong và cộng sự (2019) còn chứng minh vỏ hạt cà phê có tác dụng làm giảm cholesterol trong thí nghiệm in vitro và in vivo thông qua ức chế hấp thu cholesterol ở ruột bằng cách kích hoạt LXRα qua trung gian NPC1L1 điều hòa và can thiệp vào sự hình thành phức hợp micelle (gồm muối mật và các acid béo mạch dài) [2]. Vỏ hạt cà phê cũng có khả năng ức chế sự hấp thụ acid béo tự do qua trung gian của FAT/CD36 và cải thiện tình trạng kháng insulin thông qua AMPK, SREBP-1c và PPARγ [3]. Các thành phần chính của vỏ cà phê như acid chlorogenic và acid caffeic đều có khả năng ức chế α-amylase và α-glucosidase với giá trị IC₅₀ thấp (2-8 μg/mL) [4]. Chính từ đó, nghiên cứu tiến hành khảo sát tác dụng điều hòa glucose huyết của cao chiết từ vỏ hạt cà phê để định hướng phát triển chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh lý đái tháo đường của dược liệu này trong tương lai.

2. Thực nghiệm

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Vỏ hạt cà phê được thu vào tháng 1/2022 tại Đắk Lắk và được định danh bởi TS. Đặng Văn Sơn - Viện Sinh học Nhiệt đới. Vỏ hạt cà phê sau khi thu về được sấy khô đến khi độ ẩm dược liệu đạt dưới 13% (Dược điển Việt Nam V) và xay thô thành bột (đạt kích thước 2-3 mm, độ ẩm dược liệu là 6,5%). Bột dược liệu được chiết với dung môi nước cất với tỉ lệ 1:20 sau đó cô giảm áp để thu hồi dung môi ethanol 50% và tiếp theo cô cách thủy để thu được cao đặc từ vỏ hạt cà phê (VHCF) (độ ẩm cao chiết là 19%).

2.2. Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng (Swiss albino), 4-5 tuần tuổi trọng lượng 18-20 g được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm thuốc được nuôi theo chu kỳ 12 giờ sáng - tối, chuột được ổn định ít nhất 1 tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được nuôi đầy đủ bằng thức ăn, thực phẩm viên cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang có bổ sung nước uống. Thể tích cho chuột uống hay tiêm phúc mạc là 10 ml/kg thể trọng chuột.

2.2. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: α-glucosidase, acarbose, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG), glibenclamid (sigma- Mỹ);, bộ kít định lượng glucose (Human - Đức); D-glucose (Xilong - Trung Quốc) và một số dung môi hóa chất thông thường khác trong phòng thí nghiệm.

Thiết bị: Máy đọc vi đĩa (Biotek, Mỹ); máy li tâm hermle (Ý), máy sinh hóa bán tự động screen master 3000 (Ý), và các thiết bị thông thường khác trong phòng thí nghiệm.

2.3. Thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase

Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Muhammad Naeem Qaisar et al., (2014) có hiệu chỉnh, như sau:

Mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH = 7.0. Thêm 50 µL dung dịch α-glucosidase 0,1 U mL-1, lắc đều, ủ trong 5 phút tại 37 ^oC. Cho tiếp 50 µL dung dịch nền pNPG 3,0 mM và ủ trong 30 phút tại 37 ^oC để phản ứng xảy ra. Sau khi ủ, thêm 375 µL Na₂CO₃ 0,1 M để dừng phản ứng. Dung dịch sau đó được đo quang tại bước sóng 401 nm.

Mẫu control được chuẩn bị tương tự như mẫu thử, khi đó ta thay dung dịch mẫu bằng dung dịch đệm phosphate (mẫu control không chứa mẫu thử).

Mẫu được thử ở 5 nồng độ khác nhau (10, 5, 1, 0,5, 0,25, và 0,1 µg mL^-1), mỗi nồng độ đo 3 lần (tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử, làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tương tự như mẫu thử nhưng thay dung dịch enzyme bằng dung dịch đệm phosphate). Từ đó tính được giá trị phần trăm ức chế (I%) với từng nồng độ khảo sát là trung bình cộng của 3 giá trị mật độ quang đo được ở mỗi nồng độ và giá trị IC₅₀, là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó có thể ức chế được 50 % α-glucosidase. thử [5].

Hoạt tính ức chế α-glucosidase được tính toán như sau:

Khả năng ức chế (%) = (A_chứng- A_mẫu)/A_chứng x 100

Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau.

Acarbose (Sigma- Mỹ) được sử dụng làm chứng dương.

2.4. Thử nghiệm độc tính cấp đường uống

Dựa theo tài liệu “Phương pháp xác định độc tính của thuốc” của tác giả Đỗ Trung Đàm và quy tắc 3R trong việc sử dụng động vật thí nghiệm, tiến hành cho chuột được nhịn đói 16 giờ trước khi thử nghiệm. Thử nghiệm 10 con chuột (gồm 5 con chuột đực và 5 con chuột cái) được cho uống cao chiết VHCF với liều khởi đầu 5000 mg/kg với thể tích 0,2 ml/10 g trọng lượng chuột; lô chứng sinh lý uống nước cất được thực hiện song song kèm theo. Theo dõi trong 14 ngày, số lượng chuột chết và thời điểm chết (nếu có), trọng lượng chuột trước và sau thử nghiệm. Phân suất tử vong thấp hơn 100%, liều gây tử vong tuyệt đối không xác định được, do đó không thể xác định được LD₅₀ [6].

2.5. Thử nghiệm điều hòa glucose huyết của mẫu thử trên thực nghiệm dung nạp glucose chuột bình thường

Nghiệm pháp dung nạp glucose là một trong những test chẩn đoán tiền đái tháo đường hay đái tháo đường trên người. Theo mô hình của Tổ chức Y tế Thế giới - WHO, 75 g glucose được sử dụng theo đường uống và tiến hành đo đường huyết sau 2 giờ với giá trị chẩn đoán ≥ 200 mg/dl (đái tháo đường) và trong khoảng 140-199 mg/dl (rối loạn dung nạp glucose: impaired glucose tolerance, giai đoạn tiền đái tháo đường). Trên động vật thử nghiệm là chuột nhắt trắng, liều uống glucose là 2 g/kg thể trọng chuột và tiến hành đo đường huyết sau 30 phút và 120 phút với giá trị chẩn đoán tương tự như ở người.

Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô như sau: lô thử cho uống với 2 liều thử nghiệm liên tục trong 7 ngày và lô chứng sinh lý cho uống nước cất, lô đối chiếu cho uống glibenclamid liều 5 mg/kg. Một giờ sau khi uống mẫu thử ở ngày 7, tiến hành lấy máu đuôi chuột để xác định trị số đường huyết trước khi gây quá tải glucose (chuột được cho nhịn đói 16 giờ trước khi định lượng). Tiếp theo cho tất cả các lô uống dung dịch glucose (liều 2 g/kg thể trọng). Tiến hành lấy máu chuột định lượng đường huyết sau khi cho uống glucose ở thời điểm 30 phút và 120 phút. Định lượng glucose huyết bởi bộ kit định lượng glucose (Human- Đức) bằng máy sinh hóa bán tự động screen master 3000 (Ý) [7, 8].

2.6. Xử lý số liệu

Số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình (M) ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2016, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One - Way ANOVA và hậu kiểm bằng Student - Newman - Keuls test (phần mềm SigmaStat 3.5). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi p < 0,05 so với lô chứng.

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của VHCF

Bảng 1 cho thấy cao VHCF có tác dụng ức chế α-glucosidase (IC₅₀= 0,82 µg/mL) mạnh hơn acarbose IC₅₀= 138,2 µg/mL). Kết quả nghiên cứu này cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây của Dang Kin Thu và cộng sự (2019) cũng đã chứng minh cao chiết toàn phần và các phân đoạn hạt cà phê xanh có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh so với acarbose [9]. Các thành phần chính của vỏ cà phê như acid chlorogenic và acid caffeic đều có khả năng ức chế hoạt động của α-glucosidase với giá trị IC₅₀ thấp (2-8 μg/mL) [4]. Trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng cao chiết từ vỏ hạt cà phê có khả năng ức chế α-glucosidase là bước ngăn cản quá trình hấp thu glucose, giúp hỗ trợ điều hòa đường huyết.

Bảng 1. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của VHCF

Mẫu	Phần trăm ức chế I (%)				IC₅₀ µg/mL
Mẫu	1 µg/mL	0,5 µg/mL	0,25 µg/mL	0,1 µg/mL
VHCF	63.42 ± 0.54	25.7 ± 1.0	8.8 ± 1.2	-	0,82
Acarbose^a					138,2

Kết quả I (%) được tính dựa trên giá trị trung bình với độ lệch chuẩn n = 3. ^aChất đối chứng dương

3.2. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống của VHCF

Theo dõi 14 ngày sau khi uống cao VHCF liều 5000 mg/kg, chuột thử nghiệm vẫn sinh hoạt bình thường; lông mượt; không có cá thể nào bị tiêu chảy, kích động, co giật, li bì, chậm chạp,... (Bảng 2)

Bảng 2. Các dấu hiệu nhiễm độc sau khi uống VHCF 14 ngày

Triệu chứng	Phần trăm dấu hiệu nhiễm độc (%)
	Lô cao VHCF liều 5000 mg/kg		Lô chứng sinh lý
	Chuột đực	Chuột cái	Chuột đực	Chuột cái
Tiêu chảy	0	0	0	0
Kích động	0	0	0	0
Co giật	0	0	0	0
Li bì	0	0	0	0
Chậm chạp	0	0	0	0
Chết	0	0	0	0

Sau 14 ngày uống mẫu thử, trọng lượng cơ thể chuột của các lô thử có xu hướng tăng cân khác biệt so với trọng lượng chuột cùng giới cùng lô ngày 1 (p<0,001). Tuy nhiên, trọng lượng chuột của lô VHCF liều 5000 mg/kg không khác biệt so với lô chứng sinh lý cùng giống cùng thời điểm khảo sát, điều này cho thấy cao VHCF liều 5000 mg/kg không ảnh hưởng đến sự phát triển của chuột.

Bảng 3. Sự thay đổi trọng lượng chuột trước và sau khi uống VHCF 14 ngày

Thời điểm	Trọng lượng chuột (%)
	Lô cao VHCF liều 5000 mg/kg		Lô chứng sinh lý
	Chuột đực	Chuột cái	Chuột đực	Chuột cái
Ngày 1	20,87 ± 0,13	20,54 ± 0,19	21,03 ± 0,24	20,11 ± 0,43
Ngày 14	25,11 ± 0,24^***	26,33 ± 0,13^***	25,62 ± 0,47^***	25,77 ± 0,69^***

^(***): P<0,001 vs ngày 1 cùng giống cùng lô thử nghiệm

Nghiên cứu cũng không ghi nhận phân suất tử vong nào trên cả 2 giống chuột thử nghiệm. Các kết quả này cho thấy cao VHCF liều 5000 mg/kg không độc trên chuột thực nghiệm tương đồng với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Quân và cộng sự (2021) đã chứng minh cao chiết hạt cà phê xanh ở các liều thử nghiệm không độc trên động vật nghiên cứu [10]. Vì vậy, cao chiết VHCF là an toàn.

Dựa vào kết quả độc tính cấp đường uống xác định được ngưỡng liều an toàn, liều dùng dược liệu theo kinh nghiệm dân gian và hiệu suất chiết xuất của cao chiết, nghiên cứu xác định liều thử nghiệm dược lý trên chuột của VHCF là 0,3 g cao/kg- 0,6 g cao/kg thể trọng chuột (tương đương 2,5 g dược liệu/kg- 5 g dược liệu/kg thể trọng chuột).

3.3. Kết quả tác dụng điều hòa đường huyết của VHCF

Kết quả Hình 1 cho thấy nồng độ glucose huyết của lô uống glibenclamid giảm 24,84% khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý uống nước cất (p<0,001), điều này cho thấy glibenclamid liều 5 mg/kg gây hạ đường huyết trên chuột bình thường. Trong khi đó, lô chuột uống VHCF ở cả 2 liều thử nghiệm 0,3 g/kg- 0,6 g/kg đều có nồng độ glucose huyết không khác biệt so với lô chứng sinh lý (p=0,816; p=0,71; tương ứng). Điều này cho thấy VHCF không ảnh hưởng đến nồng độ glucose huyết ở chuột bình thường sau 7 ngày uống mẫu liên tục.

Sau 30 phút dung nạp glucose, nồng độ glucose huyết của lô chứng sinh lý tăng 90,14% khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý trước khi dung nạp glucose (p<0,001), kết quả này cho thấy nghiên cứu đã thành công trong việc triển khai mô hình gây rối loạn đường huyết trên chuột nhắt trắng bình thường mô phỏng bệnh lý tiền đái tháo đường. Lô chuột uống VHCF ở cả 2 liều thử nghiệm 0,3 g/kg- 0,6 g/kg đều có tác dụng làm giảm nồng độ glucose huyết (13,20%- 24,82%) khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh cùng thời điểm khảo sát sau 30 phút dung nạp glucose (p=0,005; p<0,001; tương ứng) nhưng yếu hơn chứng dương glibenclamid (p<0,001). Trong đó, VHCF liều 0,6 g/kg thể hiện tác dụng điều hòa glucose huyết tốt hơn VHCF liều 0,3 g/kg (p=0,012) trên thực nghiệm dung nạp glucose. Kết quả này phù hợp với thử nghiệm in vitro- cao chiết nước từ vỏ hạt cà phê có khả năng ức chế α-glucosidase mạnh. Ontawong A. và cộng sự (2019) cũng đã chứng minh dịch chiết nước từ vỏ hạt cà phê có khả năng ức chế sự hấp thụ acid béo tự do qua trung gian của FAT/CD36 và cải thiện tình trạng kháng insulin thông qua AMPK, SREBP-1c và PPARγ hỗ trợ trong việc điều hòa đường huyết [3].

Thời điểm sau 120 phút dung nạp glucose, nồng độ glucose huyết của lô chuột uống VHCF ở cả 2 liều thử nghiệm 0,3 g/kg và 0,6 g/kg đều trở về trị số bình thường. Trong khi đó, lô chứng dương glibenclamid liều 5 mg/kg vẫn còn thể hiện hạ đường huyết. Kết quả nghiên cứu cho thấy, VHCF có tác dụng điều hòa đường huyết trở về giá trị bình thường chứ không gây hạ đường huyết như glibenclamid trên thực nghiệm dung nạp glucose chuột bình thường. Điều này cho thấy ưu điểm của việc sử dụng dược liệu vỏ hạt cà phê trong việc hỗ trợ điều trị bệnh lý rối loạn đường huyết so với thuốc tân dược glibenclamid.

4. Kết luận

Cao chiết etanol 50% từ vỏ hạt cà phê có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh hơn chất đối chứng dương Acarbose, cũng như không thể hiện độc tính cấp và có tác dụng điều hòa glucose huyết trên mô hình thực nghiệm ở 2 liều thử nghiệm 0,3 g cao/kg - 0,6 g cao/kg thể trọng chuột.

Lời cám ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đắk Lắk, trong đề tài mã số 369/HĐ-SKHCN.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Đỗ Trung Đàm (2014). Phương pháp xác định độc tính của thuốc. NXB Y học, Hà Nội, 40-59.
Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Hoàng Minh, Huỳnh Ngọc Trung Dung (2012). Tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết từ quả ổi. Tạp chí Dược liệu, 17(5), 268 - 275.
Lê Văn Quân, Cấn Văn Mão. Nguyễn Việt Nam, Nguyễn Trọng Nghĩa (2021). Đánh giá độc tính cấp tính của cao chiết hạt cà phê xanh Việt Nam trên động vật thực nghiệm. Tạp chí Y học Việt Nam, 509(2), 30-33.
Duran G. S. C., Rodríguez L. V. , Ernesto F. T., Cristobal N. A. (2019). Coffee Pulp as Potential Source of Phenolic Bioactive. Hanbook Of Research On Food Science And Technology, 1, https://doi.org/10.1201/9780429487859.
Atcharaporn O., Acharaporn D., Chatchai M., Tipthida P., Anchalee P., Doungporn A., Chutima S. (2019). Lipid-lowering effects of Coffea arabica pulp aqueous extract in Caco-2 cells and hypercholesterolemic rats. Phytomedicine, 52, 187-197.
Ontawong et al., (2019). Hepatoprotective effect of coffee pulp aqueous extract combined with simvastatin against hepatic steatosis in high-fat diet-induced obese rats. Journal of Functional Foods, vol. 54, no. February, pp. 568-577.
Atcharaporn O., Oranit B., Tipthida P., Acharaporn D., Anchalee P., Manussaborn Ph., Metee J., Doungporn A., Chutima S. (2015). Caffeic and chlorogenic acids inhibit key enzymes linked to type 2 diabetes (in vitro): A comparative study. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 26, 165-170.
Muhammad N. Q., Bashir A. Ch., Muhammad U. S., Nawaz H. (2014). Evaluation of α-Glucosidase Inhibitory Activity of Dichloromethane and Methanol Extracts of Croton bonplandianum Trop J Pharm Res, , 13(11), 1833.
Koji H., Rhyoji K., Mikio I. (2006). Strain differences in the Diabetogenic Activity of Streptozotocin in Mice. Pharm. Bull., 29(6), 1110 -1119.
Dang Kim Thu, Vu Manh Hung Nguyen Thi Trang, Bui Thanh Tung (2019). Study on α-glucosidase enzyme inhibitory activity and DPPH free radical scavenging of green coffee bean extract (Coffea canephora). VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 35(2), 12-18.

A study on the blood sugar level regulation of the the extract from coffea canephora husks

Nguyen Hoang Minh¹

Phan Nhat Minh^{2, 3}

Nguyen Diep Xuan Ky^{2, 3}

Nguyen Thi Hong^{2, 3}

Tran Huy Khiem^{2, 3}

Mai Dinh Tri^{2, 3}

¹Research Center of Ginseng and Material Medical Ho Chi Minh City

²Institute of Chemical Technology, Vietnam Academy of Science and Technology

³Graduate University of Science and Technology

Abstract:

Coffee husks contain caffeine, tannin, polyphenol, pectin, monosaccharide, and disaccharide compounds, which are known to improve glucose blood levels and stimulate insulin secretion. This study evaluated the inhibitory effect of the α-glucosidase enzyme, acute toxicity, and modulatory effect on plasma glucose in an oral glucose tolerance test applied to normal mice of the extract from Coffea canephora husks. The results showed that the extract from Coffea canephora husks (5,000 mg/kg) did not cause acute toxicity in test animals. The extract from Coffea canephora husks has strong α-glucosidase enzyme inhibitory activity (IC50 = 2.3 µg/mL), which is stronger than that of acarbose (IC50 = 138.2 µg/mL). In addition, the results also showed that the extract from Coffea canephora husks (0.3-0.6 g/kg) had a modulatory effect on plasma glucose in an oral glucose tolerance test applied to normal mice, but it was weaker than that of glibenclamide. In which the extract from Coffea canephora husks (0.6 g/kg) showed a modulatory effect on plasma glucose, which was better than the extract from Coffea canephora husks (0.3 g/kg).

Keywords: coffea canephora seed bark, α-glucosidase, acute toxicity, oral glucose tolerance test.